Replik

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 14497 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Bionachahmung nativer Gewebe und Organe erfordert die Entwicklung fortschrittlicher Hydrogele. Die Strukturierung von Hydrogeloberflächen kann die zelluläre Funktionalität und therapeutische Wirksamkeit von Implantaten verbessern. Beispielsweise kann die Nanostrukturierung der Oberfläche der Intraokularlinse (IOL) die Hochregulierung von Zytoskelettproteinen (Aktin und Aktinin) in den Zellen, die mit der IOL-Oberfläche in Kontakt stehen, unterdrücken und so sekundäre Katarakte verhindern, die zu verschwommenem oder undurchsichtigem Sehen führen. Hier stellen wir eine schnelle und effiziente Methode zur Herstellung von Arrays vor, die aus Millionen einzelner Nanostrukturen auf der Hydrogeloberfläche bestehen. Insbesondere haben wir die zufällig verteilten Nanosäulen auf Poly(2-hydroxyethylmethacrylat)-Hydrogel mittels Replika-Formung hergestellt und zeigen, dass Anzahl, Form und Anordnung der Nanostrukturen vollständig einstellbar sind. Die Charakterisierung mittels Rasterkraftmikroskopie ergab, dass alle Nanosäulen eine ähnliche Form, eine enge Größenverteilung und keine signifikanten Defekte aufwiesen. Bei der Prägelithographie ist die Auswahl der geeigneten Hydrogelzusammensetzung von entscheidender Bedeutung. Da Hydrogele mit eingeprägten Nanostrukturen die natürliche Zellumgebung nachahmen, können sie in der zellbiologischen Grundlagenforschung Anwendung finden, z. B. können sie die Zellanhaftung steuern und die Zellclusterbildung durch eine spezifische Anordnung hervorstehender Nanostrukturen auf der Hydrogeloberfläche hemmen oder fördern.

Hydrogelmaterialien, die aus hydrophilen vernetzten Polymerketten bestehen, werden aufgrund ihrer Fähigkeit, große Mengen Wasser zu absorbieren und zurückzuhalten und gleichzeitig ihre unlösliche dreidimensionale Netzwerkstruktur beizubehalten, häufig in der Gewebezüchtung eingesetzt. Die Biokompatibilität von Hydrogelen wurde im Hinblick auf ihre Verwendung in der biomedizinischen Industrie seit der bahnbrechenden Arbeit von Wichterle und Lim im Jahr 19602 umfassend untersucht. Hydrogele aus natürlichen Polymeren bieten mehrere Vorteile, wie Biokompatibilität, zellkontrollierter Abbau und intrinsische zelluläre Interaktion3. Allerdings weisen sie nur begrenzte mechanische Eigenschaften auf. Im Gegensatz dazu können synthetische Polymere mit genau kontrollierten Strukturen und Funktionen hergestellt werden, obwohl ihre begrenzte Abbaubarkeit unter physiologischen Bedingungen und toxischen Chemikalien Nachteile mit sich bringen kann4. Eines der am besten untersuchten synthetischen Hydrogele basiert auf Poly(2-hydroxyethylmethacrylat, PHEMA). Dieses Polymer wird aus dem Vorläufermonomer 2-Hydroxyethylmethacrylat (HEMA) durch thermisch oder Strahlung (Gamma, UV, Blaulicht) initiierte radikalische Polymerisation5 synthetisiert. PHEMA ist ein transparentes, biokompatibles, ungiftiges, nicht abbaubares, nicht klebendes, hydrophiles Hydrogelmaterial mit einer hohen und einstellbaren mechanischen Festigkeit6 und wird im Bereich der Biomedizin, insbesondere in der Ophthalmologie, insbesondere als Kontakt- und Intraokularlinsen7, eingesetzt.

Im Laufe der Jahre wurden viele Fortschritte und Modifikationen von Hydrogelen entwickelt, die das PHEMA-Hydrogel für verschiedene biomedizinische Anwendungen nutzen8. Einer der wesentlichen Anwendungsbereiche ist die Verabreichung von Medikamenten, Proteinen oder Zellen für das Tissue Engineering9. PHEMA kann direkt in den Körper injiziert werden und ist minimalinvasiv10. Das Medikament ist normalerweise in einem Hydrogel eingekapselt11. Die Mikroporosität der Hydrogelpolymere kann auch genutzt werden, um die Diffusion molekularer Spezies in das Innere des Hydrogels hinein und aus diesem heraus zu kontrollieren. Beispielsweise kann die Anpassung der Maschenweite des Polymers zum größenselektiven Ausschluss von Proteinen und anderen unerwünschten Verunreinigungen bei therapeutischen und diagnostischen Anwendungen führen12. Eine weitere wichtige Anwendung von Hydrogelen ist der Einbau von Wachstumsfaktoren (vaskuläres Endothel, basisches Fibroblasten-, epidermales und knochenmorphogenetisches Protein) in PHEMA, wodurch die Bildung von Blutgefäßen gefördert wird13. Die Nanostrukturierung der Oberfläche würde eine Reihe neuer Anwendungsmöglichkeiten bieten, z. B. die Unterdrückung der Bildung von Zytoskelettproteinen14 auf der Oberfläche der Intraokularlinse (IOL), was zu deren Veränderung von transparent zu undurchsichtig führen könnte. Die Bestätigung dieser Hypothese wird für die Herstellung einer IOL, die gegen sekundären Katarakt resistent ist, von entscheidender Bedeutung sein. Um diese Anwendungen zu ermöglichen, ist es jedoch notwendig, skalierbare Methoden zu entwickeln, um große Oberflächen zu geringen Kosten zu erzeugen.

Lithographiemethoden in Kombination mit Replika-Formen (auch Gussformen genannt) ermöglichen das Aufdrucken der gemusterten Struktur aus einer festen Form auf eine Hydrogeloberfläche während ihrer Herstellung15,16; Die negativen und positiven Merkmale der Form führen zu Vorsprüngen oder Poren. Eine weitere Modifizierungsmethode der Hydrogelchemie und Oberflächentopographie kann durch Excimer-Laser erreicht werden17. Die Lasermodifikationsbehandlung ermöglicht Veränderungen der physikalisch-chemischen Oberflächeneigenschaften, z. B. können die laserinduzierten Strukturen die Zytokompatibilität steuern oder als antibakterielle Substrate und in plasmonischen Nachweissystemen eingesetzt werden18. Die Hydrogelvorsprünge können die Oberflächentopographie verändern, was die In-vivo-Umgebung der Zelle nachahmt und die Zell- oder Proteinanhaftung beeinflusst19. Eine solche modifizierte Oberfläche ermöglicht die Untersuchung von Zell-Material-Wechselwirkungen20.

In diesem Artikel wird über die Herstellung nanostrukturierter Muster auf dem PHEMA-Hydrogel berichtet, die aus zufällig verteilten Nanosäulen bestehen, die für das menschliche Auge unsichtbar sind. Wir haben einen fokussierten Ionenstrahl (FIB) eingesetzt, um eine Stempelform mit der gewünschten Nanosäulenanordnung herzustellen, und das Muster mithilfe einer Replikaformung auf das Hydrogel übertragen. Die verwendete Herstellungsmethode ist schnell und reproduzierbar. Wir besprechen auch geeignete Hydrogel-Mischungszusammensetzungen für den Druck und beschreiben Nanopillar-Abmessungen für verschiedene Muster. Außerdem haben wir eine breite Palette analytischer Techniken angewendet, um zu zeigen, dass nanostrukturiertes Hydrogel seine günstigen Eigenschaften für ophthalmologische Anwendungen behält. Diese Studie erweitert die Einsatzmöglichkeiten modifizierter Hydrogele, die in der Augenheilkunde als kataraktresistente Intraokularlinsen eingesetzt werden könnten.

Als Form haben wir ein Stück Silizium (1 × 1 cm2) ausgewählt, das aus einem (100)-orientierten, mit Bor dotierten Siliziumwafer geschnitten wurde, der eine 1–2 nm dicke native Oxidschicht (Firma Sil'tronix) aufweist. Die Siliziumformen wurden mit einem fokussierten Ionenstrahl im LYRA3 FIB-SEM-Instrument (TESCAN) unter Verwendung von 30 keV-Galliumionen (Strahlströme 160 pA und 42 pA) hergestellt. Die Parameter des Formmusters wurden durch das benutzerdefinierte Skript definiert (eine detaillierte Skriptbeschreibung finden Sie in den Zusatzinformationen). Die Silikonformmuster wurden durch REM im selben Instrument unter Verwendung einer Beschleunigungsspannung von 5 kV und eines Strahlstroms von 160 pA charakterisiert.

Das Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) (PHEMA)-Hydrogel wurde unter Verwendung von photopolymerisierendem 2-Hydroxyethylmethacrylat (HEMA) (Reinheit ≥ 99 %, Sigma-Aldrich) hergestellt. Zur Polymerisation wurde Ethylenglykoldimethacrylat (EGDMA) (Reinheit 98 %, Sigma-Aldrich) als Vernetzungsmittel und 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenon (DMPA) als Photoinitiator (Reinheit 99 %, Acros) verwendet Bioprodukte). Das verwendete Reinstwasser (Typ 1 nach ISO 3696) wurde mit einem Millipore-Reinigungssystem (MilliQ Academic, Millipore, Frankreich) aufbereitet.

Die Morphologie und Abmessungen der gefrästen Merkmale und aufgedruckten Muster auf dem Hydrogel wurden mit dem Rasterkraftmikroskop (AFM) Bruker Dimension Icon mit einer ScanAsyst-Spitze im Kontaktmodus in der Luft gemessen (Spitzenkraftsollwert 2 nN, Rückkopplungsverstärkung 15, Scangröße 5). × 5 μm2, 512 × 512 Pixel). Die gemessenen AFM-Daten wurden mit gängigen Ansätzen verarbeitet, die in der Gwyddion-Software21 implementiert sind. Die korrigierten Bilder wurden verwendet, um die Tiefe und Höhe der Nanostrukturen direkt in Gwyddion sowie deren Durchmesser mithilfe der ImageJ-Software22 zu bestimmen.

Die Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) der getrockneten Hydrogele wurde mit dem Kratos AXIS Supra unter Verwendung monochromatisierter Al Ka-Strahlung (Emissionsstrom 15 mA) gemessen. Die Photoelektronen wurden in normaler Emissionsgeometrie bei eingeschalteter Magnetlinse gesammelt. Übersichtsspektren wurden mit einer Durchgangsenergie von 80 eV und einem Energieschritt von 1 eV aufgenommen. Detaillierte Photoelektronenspektren wurden mit einer Durchgangsenergie von 20 eV und einem Energieschritt von 0,1 eV gemessen. Zur Ladungsneutralisierung wurde eine Elektronenflutkanone verwendet; Die ladungsinduzierte Verschiebung wurde auf die Bindungsenergie von 285,0 eV der Hauptkomponente des C 1 s-Peaks korrigiert23.

Die Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR) wurde an getrockneten PHEMA-Hydrogelproben innerhalb und außerhalb des Nanomusters mit dem Hyperion 3000/Vertex (Bruker) durchgeführt. Der Reflexionsgrad wurde in einem Wellenzahlbereich zwischen 4000 und 600 cm−1 mit 128 Scans pro Probe und bei einer Auflösung von 4 cm−1 unter Umgebungsluftbedingungen gemessen.

Die Weitwinkel-Röntgenstreuungsmessungen (WAXS) wurden auf einem Rigaku Smartlab 3-Instrument durchgeführt, das mit einer rotierenden Cu-Anode und einem Parallelstrahlaufbau zur Erzeugung von Cu-Kα-Strahlung (λ = 0,1541 nm) ausgestattet war; Die 0,3-mm-Lochblende und der 0,2-mm-Kollimator begrenzen die Strahlgröße auf etwa 0,3 mm Durchmesser. Die Daten wurden mit einem zweidimensionalen HyPiX-3000-Aktivmatrixdetektor gesammelt, der 150 mm von der Probe entfernt positioniert war. WAXS wurde in Transmissionsgeometrie gemessen. Von jedem Scanbereich wurden zweidimensionale Diffraktogramme gemessen. Die Intensität aus Diffraktogrammen wurde durch azimutale Integration neu berechnet, um ein eindimensionales Radialprofil zu erhalten. Der Abstand wurde anhand des Bragg-Gesetzes24 bestimmt, das identifizierte Peakpositionen aus den Profilen verwendet. Die Spektren von 0 bis 10° wurden nicht berücksichtigt, da sie durch einen großen Fehler beeinflusst wurden, der durch Luftstreuung verursacht wurde.

Die Lichtdurchlässigkeit wurde im Hellfeldmodus mit einem Nikon Eclipse Ti-Mikroskop untersucht, das mit einer LU Plan Fluor 10 × NA 0,3-Objektivlinse, einem Weißlicht-Halogenstrahler, einer Jenoptic Progres MF-Mikroskopkamera und NIS-Software (Nikon) ausgestattet war.

Der Wasserkontaktwinkel der Hydrogeloberfläche wurde mit dem See System E (Advex Instrument sro) unter Verwendung der Software See System for Surface Energy Measurement gemessen und ausgewertet. Aus der Mikrospritze wurden Wassertropfen (5 μl) auf das getrocknete und gereinigte PHEMA-Hydrogel aufgetragen. Um genügend Statistiken zu erhalten, wurde eine Messung zwölfmal wiederholt. Eine zusätzliche Analyse der getrockneten PHEMA-Proben zum Wasserkontaktwinkel finden Sie in den Zusatzinformationen.

Ziel dieser Arbeit ist es, durch Replika-Formung eine Hydrogeloberfläche mit Anordnungen zufällig verteilter Nanosäulen spezifischer Abmessungen zu erhalten. Als Form haben wir ein Stück Silizium mit einer 1–2 nm dicken nativen Oxidschicht verwendet. Ein Siliziumwafer ist ein flaches, klar definiertes, kontaminationsfreies und erschwingliches Substrat. Die Form besteht aus kreisförmigen Löchern mit einer Tiefe von mehreren zehn Nanometern als Grundmerkmal; Diese Löcher werden als Nanosäulen im Hydrogel reproduziert. Wir haben eine Reihe von Proben mit unterschiedlichen Sputterparametern (Ionendosis, Strahlstrom und Mahlzeit) hergestellt, um die Eignung der Form zu beurteilen. Basierend auf diesen Tests haben wir zwei funktionale Stempelformen ausgewählt. Das erste hat eine Fläche von 540 × 540 µm2 und umfasst 1.361.700 Strukturen, die mit einem Strahlstrom von 160 pA gefräst wurden (Fertigungszeit 15 Stunden). Die zweite Form verfügt über zwei Arrays von 90 × 90 µm2, die jeweils aus 37.825 Elementen unterschiedlicher Strukturgrößen bestehen und mit Strahlströmen von 42 pA bzw. 160 pA hergestellt wurden, wobei die Gesamtherstellungszeit 1 Stunde betrug. Der kleinere Strahlstrom führt typischerweise zu kleineren gefrästen Abmessungen der Merkmale; Daher bezeichnen wir der Einfachheit halber 42 pA als kleine und 160 pA als große Merkmale. Die Übersichts- und Detailbilder, die mittels REM (5 kV, 160 pA) von Schimmelpilzen aufgenommen wurden, sind in den Abbildungen dargestellt. 1a, b und 2. Ein pfeilförmiger Marker (150 × 150 µm2) ermöglichte eine einfache optische Lokalisierung der Muster.

(a) Übersicht über das nanostrukturierte Array mit einer Fläche von 540 × 540 µm2, bestehend aus 1.361.700 Löchern auf der Silikonform. (b) Die detaillierte Ansicht der Anordnung großer (30 kV, 160 pA) Löcher (Maßstabsleiste 1 µm). Die Bilder wurden mittels REM (5 kV, 160 pA) aufgenommen.

(a) Silikonform mit pfeilförmigem Marker und zwei 90 × 90 µm2 großen Arrays, die jeweils aus 37.825 Löchern bestehen (Maßstab 100 µm). (b,c) Detailansicht von Arrays aus (b) kleinen (30 kV, 42 pA) und (b) großen (30 kV, 160 pA) Löchern (Maßstabsbalken 1 µm). Die Bilder wurden mittels REM (5 kV, 160 pA) aufgenommen.

Ein kritischer Punkt für die Formlithographie ist die Verwendung eines Hydrogels mit Eigenschaften, die eine ausreichende Quellung, hydrolytische Stabilität und, was noch wichtiger ist, ein einfaches Ablösen des Hydrogels von der Si-Form gewährleisten, ohne dass sowohl das Hydrogel als auch die Form beschädigt werden. Um das erforderliche Verhalten zu erzielen, wurde die Wirkung der Zusammensetzung durch die Herstellung von HEMA-Mischungen in unterschiedlichen Gewichtsverhältnissen untersucht (Tabelle 1). Vier Zusammensetzungen der PHEMA-Hydrogele (H1, H2, H3 und H4) mit unterschiedlichen Konzentrationen von EGDMA und HEMA wurden hergestellt, analysiert und getestet. Die Abhängigkeit des Quellverhältnisses jedes Hydrogels ist in Abb. 3 dargestellt. Die geringere Menge (0,25 Gew.-%) an EGDMA in der H3-Mischung führt zu einer geringeren Dichte des Polymernetzwerks und folglich zu einer höheren Wasseraufnahme und einer höheren Wasseraufnahme Unfähigkeit des Hydrogels, seine ursprüngliche Form und seinen Wassergehalt beizubehalten. Im Gegensatz dazu hatte die H4-Mischung eine höhere Konzentration (1,20 Gew.-%) an EGDMA, was aufgrund der höheren Dichte des Polymernetzwerks zu einer geringeren Quellung führte. Allerdings war das Hydrogel nicht in der Lage, das Wassergleichgewicht aufrechtzuerhalten: Die Wasserretention zeigte einen abnehmenden Trend (der Wassergehalt nahm zwischen 7 und 42 Tagen um 3 % ab), was für eine langfristige Anwendung als IOL ungeeignet war. Die Mischungen H1 und H2 mit 0,85 Gew.-% EGDMA erreichen nach drei Tagen (H1) und sieben Tagen (H2) eine ausreichende Hydrogelquellung und -stabilität, wobei das Quellverhältnis im Vergleich zum Originalgewicht bis zu 0,5 beträgt.

Quellverhältnis der Hydrogelmischungen H1 (schwarz), H2 (rot), H3 (blau) und H4 (grün). Zur Orientierung des Auges werden die gemessenen Punkte durch Hilfslinien verbunden.

Beide Mischungen wurden in der Form vernetzt, in hochreinem Wasser gequollen und abgezogen. Wir haben festgestellt, dass H2 keine hochwertige nanostrukturierte Oberfläche bildet und außerdem PHEMA-Rückstände auf der Formoberfläche verbleiben. H2-Hydrogel ist aufgrund des höheren Wassergehalts in der Polymermischung weicher als H1; Infolgedessen behielten die hergestellten Nanostrukturen ihre Form nicht. Die Form wurde von H2-Rückständen gereinigt, indem sie einige Stunden lang in eine Mischung aus Wasser und Ethanol25 gegossen wurde. Aus der H1-Mischung hergestellte Nanostrukturen waren relativ steif und es blieben keine Rückstände auf der Form zurück; Daher wurden alle folgenden Experimente mit der H1-Mischung durchgeführt.

Die nanostrukturierte PHEMA-Oberfläche wurde mithilfe einer Silikonform mit einem lithografischen Muster hergestellt. Zunächst wurde dem HEMA-Monomer der DMPA-Photoinitiator mit einer bestimmten Konzentration (siehe Tabelle 1) zugesetzt. Anschließend wurden das Vernetzungsmittel EGDMA und Reinstwasser zugegeben; Die resultierende Mischung wurde gerührt, bis eine homogene Flüssigkeit erhalten wurde. Die Lösung wurde dann auf die Si-Form gegossen und 10 Minuten lang unter Umgebungsbedingungen mit UV-Strahlung (Wellenlänge 365 nm, Leistung 36 W) bestrahlt, wobei eine UV-Lampe 15 cm von der Probe entfernt platziert wurde. Die Wellenlänge wurde aufgrund der hohen Absorption der Strahlung durch DMPA bei 365 nm26 gewählt; Unsere experimentellen Daten zeigen, dass die ordnungsgemäße Polymervernetzung des Hydrogels nach 10 Minuten Bestrahlung erreicht wurde. Nach der Bestrahlung wurde das PHEMA-Hydrogel in hochreines Wasser getaucht, um nicht reagierte Rückstände zu entfernen; Das Hydrogel wurde aus der Wasserumgebung entfernt und seine Oberfläche vorsichtig mit Filterpapier gereinigt. Anschließend wurde das Hydrogel für weitere zwei Tage in frisches Reinstwasser getaucht, um die restlichen nicht umgesetzten Bestandteile zu entfernen. Wenn das PHEMA-Hydrogel nicht für das Experiment verwendet wurde, wurde es in der Wasserumgebung gelagert; Nach jedem Experiment wurde das Wasser durch eine frische Ladung ersetzt.

Wir haben die hergestellten Formen und makellosen und nanostrukturierten PHEMA-Oberflächen mithilfe einer Reihe analytischer Methoden charakterisiert. Die Größe der Löcher in der Form und der Nanosäulen auf dem Hydrogel wurde mittels AFM bestimmt. Die gemessene Siliziumform mit einer gesputterten Fläche von 540 × 540 µm2, bestehend aus großen Löchern, ist in Abb. 4 dargestellt, und die Anordnungen großer und kleiner Nanosäulen auf Hydrogelproben sind in Abb. 5 zu sehen. Als das Hydrogel aus a entnommen wurde In einer flüssigen Umgebung begann es sofort zu schrumpfen. Daher musste es teilweise getrocknet werden, um eine stabile Zusammensetzung und Größe zu erreichen, was die AFM-Messungen ohne nennenswerte Drift ermöglichte. Der Trocknungsprozess mit der AFM-Messung dauerte insgesamt zwei Stunden. Eine weitere Voraussetzung für das AFM ist eine ebene Oberfläche. Für die Referenzprobenmessung wurde die ebene Oberfläche durch Formen der Hydrogelmischung unter Verwendung der rechteckigen Kunststoffbox als Form erhalten.

Detailliertes AFM-Bild einer Silikonform mit einer Anordnung aus großen Löchern.

AFM-Bilder der (a) großen und (b) kleinen geprägten Nanosäulen auf dem Hydrogel.

Alle gemessenen Nanosäulen waren ungefähr kreisförmig; Daher könnte ihr Durchmesser aus ihrer Fläche unter Verwendung der Gleichung für die Kreisfläche berechnet werden. Die Nanopillenbereiche wurden mithilfe des in der ImageJ-Software implementierten Schwellenwertverfahrens bestimmt; Der Schwellenwert wurde auf 89 % und 94 % der Gesamthöhe für große und kleine Nanosäulen festgelegt. Die Parameter einzelner Pfeiler/Löcher wurden mit einer Zuverlässigkeit von 95 % statistisch verarbeitet. Wir stellen fest, dass die Oberseite des Lochs und die Unterseite der Säule deutlich breiter sind als der Rest der Nanosäule, was auf die deutliche Verbreiterung des FIB-Strahlprofils durch einen exponentiellen Schwanz geringer Intensität zurückzuführen ist27,28; Daher sollte dieses Verfahren sorgfältig durchgeführt werden. Die Lochtiefe in der Silikonform und die aus den AFM-Daten ermittelte Höhe der eingeprägten Nanosäulen sind in den Tabellen 2 und 3 aufgeführt. Die Tiefen sowohl der großen als auch der kleinen Löcher in der Stempelform waren konsistent und stimmten mit den berechneten Werten überein, wie in der Tabelle gezeigt 2. Die theoretischen Berechnungen sind in den Zusatzinformationen beschrieben.

Tabelle 3 zeigt die AFM-Ergebnisse der gemessenen Abmessungen der Nanosäulen auf der frisch hergestellten Hydrogelprobe (als frisch gekennzeichnet) und die Ergebnisse derselben Probe, gemessen nach vier Tagen, während derer die Probe in destilliertem Wasser gelagert wurde, um ein Austrocknen zu verhindern (als gebraucht gekennzeichnet). Die gebrauchte Probe wurde vor jeder AFM-Messung ebenfalls teilweise getrocknet, wie oben beschrieben.

Die chemische Analyse von getrocknetem PHEMA wurde mittels XPS und FTIR durchgeführt. Die Photoelektronenspektren von PHEMA-Proben zeigen die für PHEMA erwarteten Kohlenstoff-C1s- und Sauerstoff-O1s-Peaks; Darüber hinaus sind kleine Peaks von Stickstoff N 1s und Silizium Si 2p und 2s vorhanden (Abb. 6a). Die Siliziumpeaks stammen wahrscheinlich von der Silikonstempelform und N 1 aus der Umgebung während der Hydrogelbehandlung. Wir haben uns auf die C 1s konzentriert, da diese für die chemische Charakterisierung von HEMA-basierten Polymeren am aussagekräftigsten sind. Wir haben fünf Peakkomponenten im C 1s-Peak bestimmt und uns dabei auf typische Gruppen bezogen, die in PHEMA23,29,30,31,32 dargestellt sind. Wir verglichen die Photoelektronenspektren, die auf der unmodifizierten (Abb. 6b) und der nanostrukturierten Oberfläche (Abb. 6c) gemessen wurden. Da es keine beobachtbaren Unterschiede gab, kamen wir zu dem Schluss, dass die Modifikation des PHEMA-Hydrogels keinen messbaren Einfluss auf die resultierende chemische Zusammensetzung hat.

Photoelektronenspektren der getrockneten PHEMA-Oberfläche mit den gezeigten Komponenten im (a) Übersichtsspektrum und die detaillierten C 1s-Spektren der (b) unmodifizierten und (c) modifizierten Oberfläche mit angepassten Komponenten.

Die FTIR-Analyse wurde verwendet, um chemische Bindungen innerhalb von PHEMA-Proben zu identifizieren. Die FTIR-Spektren der unmodifizierten und strukturierten Hydrogeloberfläche sind in Abb. 7 dargestellt. Wir haben charakteristische Methylen-, Carbonyl- und Hydroxylgruppen bestimmt, die häufig in PHEMA-Hydrogelen vorkommen33. Die Spektren umfassten –OH-Streckschwingungsbanden bei 3590 cm–1 mit einer geringeren Intensität und einer leichten Bandenverschiebung zu höheren Frequenzen, die durch die PHEMA-Dehydrierung vor der Messung verursacht wurde34. Streckschwingungen von C–H traten bei etwa 3975 und 2890 cm−1 auf; Die Streckung von C=O wurde bei 1740 cm–1 beobachtet, und die für PHEMA charakteristische Absorptionsbande von C–O wurde mit Peaks bei 1290 cm–1, 1197 cm–1 und 1094 cm–1 beobachtet. Alle aufgezeichneten Daten in den Spektren bestätigten, dass die chemische Zusammensetzung auf der strukturierten und unmodifizierten Oberfläche identisch ist.

FTIR-Spektren der getrockneten Hydrogel-PHEMA-Proben auf der unmodifizierten (Oberfläche) und nanostrukturierten Oberfläche (Muster).

Wir verwendeten Röntgenstreuung (WAXS), um die Atomstruktur der getrockneten nichtkristallinen PHEMA-Proben zu untersuchen. Im Transmissionsmodus haben wir die gesamte Probe gescannt, um etwaige Veränderungen in den mit dem Nanomuster verbundenen Spektren festzustellen. Wir identifizierten isotrope Debye-Ringe in zweidimensionalen Diffraktogrammen (siehe Zusatzinformationen) und reduzierten sie durch azimutale Integration der Intensität in radiale Profile. In den Spektren (Abb. 8) beobachteten wir drei breite Peaks bei 17,8°, 30,4° und 41,1°, entsprechend den d-Abständen (0,50 ± 0,03) nm, (0,29 ± 0,01) nm und (0,22 ± 0,01). ) nm bzw. Die ersten beiden Peaks ähneln den Ergebnissen mit PHEMA-Material35, wobei der erste Peak dem Polymer zugeschrieben wurde, während der zweite der Paarverteilung von Wassermolekülen zugeschrieben wurde.

Radiales Intensitätsprofil, erhalten durch WAXS-Messung der getrockneten PHEMA-Hydrogelprobe. Die Spitzenpositionen sind durch vertikale Linien markiert.

Um die Biokompatibilität zu beurteilen, haben wir menschliche Fibroblasten auf der PHEMA-Hydrogeloberfläche kultiviert (drei Zellen in Abb. 9a dargestellt). Die Fibroblasten zeigten während der viertägigen Beobachtung unter dem Mikroskop keine Anzeichen, die auf das Vorhandensein einer Substratzytotoxizität hinweisen würden. Das Fluoreszenzbild des Fibroblasten ist in den Zusatzinformationen dargestellt.

Hydrogeloberfläche mit kultivierten menschlichen Fibroblasten (Maßstabsbalken 100 µm). Phasenkontrastbild (a) zeigt die Oberfläche mit dem Nanosäulen-Array (weißes Rechteck); Die gesputterte Pfeilform (siehe Abb. 1) wird von der durch das gelbe Rechteck markierten Zelle abgedeckt. Bild (b) zeigt das Detail des Bereichs (grünes Rechteck), der aus unmodifizierter Hydrogeloberfläche (obere Hälfte) und Nanomuster (untere Hälfte) besteht, mit dem entsprechenden Hellfeldbild in (c).

Um die Lichtdurchlässigkeit zu bewerten, haben wir uns auf die Oberfläche des nanostrukturierten Hydrogels konzentriert und die durchschnittliche Lichtintensität in vier interessierenden Bereichen (32 × 32 Pixel) innerhalb des nanostrukturierten Bereichs und vier außerhalb (rote und blaue Markierungen in Abb. 9b) gemessen. Die mittlere Graustufenintensität betrug 6851 ± 46 (1 SD) für die nanostrukturierte Oberfläche und 6786 ± 72 für die Referenzoberfläche: Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Messungen auf dem nanostrukturierten Bereich und außerhalb (t-Test-P-Wert = 0,17). Der mögliche geringe Anstieg stünde im Einklang mit den theoretischen Konzepten, wonach schräge Teile von Oberflächen Reflexionen reduzieren und somit die Durchlässigkeit erhöhen36. Wir kamen daher zu dem Schluss, dass das eingeführte Nanomuster keinen Einfluss auf die Durchlässigkeit des PHEMA-Hydrogels hat. Darüber hinaus sind die Nanosäulen nicht wie erwartet im Hellfeld oder sogar in Phasenkontrastbildern (aufgenommen mit der Objektivlinse Plan Fluor 10 × NA 0,3 Ph1) sichtbar (Abb. 9c).

Die Wiederholbarkeit des Stempelformprozesses wurde durch die Herstellung von zehn gemusterten Hydrogelproben überprüft, und die resultierenden gemusterten Anordnungen waren immer noch dieselben. Der entscheidende Faktor für eine gute Wiederholbarkeit sind gut ausgewogene Komponenten in der Hydrogelmischung, die keine Rückstände auf der Formoberfläche hinterlassen. Wir haben das beste Komponentenverhältnis (in Tabelle 1 mit H1 gekennzeichnet) mit 92,47 Gew.-% für das HEMA-Monomer, 5,50 Gew.-% für Reinstwasser, 0,85 Gew.-% für EGDMA und 1,18 Gew.-% für DMPA ermittelt. Die anderen betrachteten Hydrogele H2–H4 waren aus verschiedenen Gründen für unsere Anwendung ungeeignet, darunter die Unfähigkeit, die ursprüngliche Form beizubehalten, die Bildung unvollständiger Nanosäulen auf der Oberfläche oder die Unfähigkeit, das Wasservolumen rechtzeitig beizubehalten.

Der Durchmesser der Hydrogel-Nanosäulen bleibt bei der frischen (klein 95 %, groß 102 % des tatsächlichen Lochdurchmessers) und der verwendeten Probe (klein 90 %, groß 90 % des tatsächlichen Lochdurchmessers) nahezu gleich. Die gemessenen Lochtiefen in der Form entsprechen theoretisch ermittelten Werten (der Unterschied beträgt ca. 16 %). Im Gegensatz dazu beträgt die Höhe der frisch hergestellten kleinen und großen Hydrogel-Nanosäulen 74 % bzw. 49 % der tatsächlichen Tiefe der Löcher in der Form, wahrscheinlich weil die Hydrogelmischung die Formlöcher nicht vollständig ausfüllt. Darüber hinaus verliert frisches Hydrogel unter Umgebungsbedingungen Wasser und schrumpft. Daher zeigte die gebrauchte Probe im Vergleich zur frischen Probe eine Verringerung der Höhe der Nanosäulen um etwa 22,5 % und des Durchmessers um 8,5 %. Darüber hinaus ist die Größenverringerung teilweise irreversibel, da das gebrauchte Hydrogel in Wasser nicht vollständig zu seiner vorherigen Größe zurückkehren konnte.

Wir haben die mechanischen und chemischen Eigenschaften des nanostrukturierten Hydrogels PHEMA bewertet und mit dem unmodifizierten verglichen. Wir konnten keine Verringerung der Lichtdurchlässigkeit, Transparenz oder Verringerung der Biokompatibilität feststellen. Daher hat die Nanostrukturierung keine nachteiligen Auswirkungen auf ophthalmologische Anwendungen. Weitere experimentelle Arbeiten sind erforderlich, um die Wirkung des Nanomusters auf die auf seiner Oberfläche kultivierten Zellen zu bewerten.

Zusammenfassend haben wir eine Reihe von Nanosäulen auf der Hydrogeloberfläche hergestellt und dabei die von FIB hergestellte Silikonform für den Abdruck verwendet. Wir haben die Formen verwendet, um eine Hydrogeloberfläche mit 1.361.700 Nanosäulen herzustellen, die zufällig auf einer Fläche von 540 × 540 μm2 angeordnet sind, was für Zellanheftungsanwendungen ausreichend ist. Die AFM-Bildgebung zeigt, dass die Hydrogel-Nanosäulen von höchster Qualität und ohne Mängel sind. Die Nanosäulen weisen eine enge Größenverteilung sowohl in der Höhe als auch im Durchmesser auf. Ihre Nanodimensionen gewährleisteten ihre volle Transparenz.

Wir haben die chemische Zusammensetzung und das Vorhandensein von Bindungen des unmodifizierten und nanostrukturierten PHEMA durch XPS und FTIR bestimmt. Diese Messungen bestätigten, dass die Hydrogeleigenschaften während der Herstellung erhalten bleiben. Das ausgewählte Hydrogel PHEMA ist ein gängiges biokompatibles und ungiftiges Hydrogelmaterial, wie unsere Biokompatibilitätstests gezeigt haben.

Das Array kann Millionen zufällig positionierter oder weiträumig geordneter Nanostrukturen mit wohldefinierten Formen umfassen. Die Nanostrukturen auf Hydrogeloberflächen finden vielfältige Anwendungsmöglichkeiten im Tissue Engineering, in der Arzneimittelabgabe, in der Augenheilkunde und in der zellbiologischen Grundlagenforschung. Die schnelle Herstellung und Reproduzierbarkeit der nanostrukturierten Hydrogele könnte für die biomedizinische Industrie attraktiv sein, z. B. für kataraktresistente nanostrukturierte Intraokularlinsen. Die biologische Wirksamkeit nanostrukturierter PHEMA-Hydrogele gegen die Verschmutzung des Zytoskelettproteins wird in vitro an menschlichen Hautfibroblasten evaluiert und wird Gegenstand zukünftiger Forschung sein.

Intraokularlinse

2-Hydroxyethylmethacrylat

Poly(2-hydroxyethylmethacrylat)

Ethylenglykoldimethacrylat

2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenon

Ultraviolett

Fokussierter Ionenstrahl

Rasterelektronenmikroskopie

Rasterkraftmikroskopie

Röntgenphotoelektronenspektroskopie

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie

Weitwinkel-Röntgenstreuung

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Der Autor dankt Dr. David Pavliňák für die XPS- und FTIR-Messungen, Dr. Jiří Novák für die WAXS-Analyse und Datenverarbeitung, Frau Alžběta Kecíková für die Wasserkontaktwinkelmessungen und Dr. Matthias Blatnik für die Ergebnisbesprechung.

Diese Forschung wird von der Technischen Universität Brünn, Internes Stipendienprojekt, Reg. unterstützt. Nr. CZ.02.2.69/0.0/0.0/19_073/0016948.

CEITEC – Mitteleuropäisches Technologieinstitut, Technische Universität Brünn, Purkyňova 123, 612 00, Brünn, Tschechische Republik

Tomáš Krajňák, Eva Černá, Tomáš Šamořil, Daniel Zicha, Lucy Vojtová und Jan Čechal

Institut für Physikalische Technik, Technische Universität Brünn, Technická 2896/2, 616 69, Brünn, Tschechische Republik

Markéta Šuráňová, Tomáš Šamořil, Daniel Zicha & Jan Čechal

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Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und beteiligten sich an der Erstellung des Manuskripts. TK: Leitung des Experiments, Herstellung und Charakterisierung (AFM, FIB-SEM, XPS, Skriptcode), Manuskripterstellung, E.Č.: Herstellung (Hydrogelproben, FTIR, Wasserkontaktwinkel), Manuskripterstellung, M.Š .: Experiment vorschlagen, Manuskript schreiben, Charakterisierung (Zytotoxizität, Lichtdurchlässigkeit, Fluoreszenz), T.Š.: Herstellung (FIB-SEM), Aufsicht, DZ, LV, J.Č.: Experiment vorschlagen, Finanzierungsbeschaffung und Aufsicht.

Korrespondenz mit Tomáš Krajňák oder Lucy Vojtová.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Krajňák, T., Černá, E., Šuráňová, M. et al. Nachgebildete nanostrukturierte PHEMA-Hydrogeloberflächen für ophthalmologische Anwendungen. Sci Rep 12, 14497 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-18564-3

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Eingegangen: 02. April 2022

Angenommen: 16. August 2022

Veröffentlicht: 25. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18564-3

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